在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中我們正面臨一個(gè)越來越普遍的問題能不能在一個(gè)小試管里同時(shí)檢測(cè)幾十種蛋白傳統(tǒng)方法如ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定通常一次只測(cè)一個(gè)指標(biāo)好比“逐個(gè)點(diǎn)名”。可當(dāng)研究者面對(duì)炎癥風(fēng)暴、腫瘤微環(huán)境或疫苗免疫應(yīng)答時(shí)他們需要同時(shí)觀察一群相互關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子和標(biāo)志物。逐個(gè)檢測(cè)不僅樣本不夠用還會(huì)丟失蛋白之間動(dòng)態(tài)變化的“協(xié)同信息”。于是一項(xiàng)顛覆性技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生——磁珠液相懸浮多因子檢測(cè)技術(shù)。它用一個(gè)樣本、一次反應(yīng)就能同時(shí)給出幾十種蛋白的定量結(jié)果。今天大家熟悉的Luminex、Bio-Plex以及國(guó)內(nèi)外各類液相芯片平臺(tái)都源于這一技術(shù)思想。但這套巧妙的方法并非一蹴而就。它的故事比Luminex公司本身要早得多。一、最初的靈感為什么要把抗體“搬”到微球上傳統(tǒng)的ELISA把抗體固定在平底孔板表面樣本中的目標(biāo)蛋白被“捕獲”后再用酶標(biāo)抗體顯色。這種方法精準(zhǔn)可靠但有一個(gè)天然局限——平面上的反應(yīng)效率有限而且一個(gè)孔只能對(duì)應(yīng)一種蛋白。于是科學(xué)家開始逆向思考如果不把抗體固定在板上而是固定在無(wú)數(shù)個(gè)微小的球上呢微球beads非常小直徑通常只有幾微米但比表面積很大。把它們懸浮在液體中抗體和抗原可以在三維空間里自由碰撞、充分結(jié)合反應(yīng)效率遠(yuǎn)高于平面。這個(gè)思路就是“液相懸浮陣列”Suspension Array的雛形。更重要的是不同微球可以“分工合作”。比如A微球?qū)ｉT捕獲IL-6B微球?qū)ｉT捕獲TNF-αC微球?qū)ｉT捕獲IL-8……把它們?nèi)炕煸谝粋€(gè)試管里理論上就能同時(shí)檢測(cè)多種蛋白。但問題也隨之而來所有微球混在一起后儀器怎么知道眼前這顆微球是檢測(cè)IL-6的還是檢測(cè)TNF-α的二、核心突破給每顆微球發(fā)一張“身份證”這個(gè)難題催生了整個(gè)技術(shù)最核心的發(fā)明——編碼微球Encoded Beads。簡(jiǎn)單來說就是給每一類微球賦予一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的“身份標(biāo)簽”。最經(jīng)典的方式是熒光編碼在微球內(nèi)部摻入不同組合、不同濃度的熒光染料。比如微球A紅色熒光高 橙色熒光低 → 檢測(cè)IL-6微球B紅色熒光中 橙色熒光高 → 檢測(cè)TNF-α微球C紅色熒光低 橙色熒光中 → 檢測(cè)IL-8這樣一來儀器檢測(cè)時(shí)先用一束激光激發(fā)“編碼熒光”立刻就能識(shí)別出“這是哪類微球、負(fù)責(zé)檢測(cè)哪個(gè)蛋白”然后再用另一束激光讀取“報(bào)告熒光”的強(qiáng)度就能知道這個(gè)蛋白有多少。編碼微球的出現(xiàn)讓“多因子同時(shí)檢測(cè)”從幻想變成了可操作的現(xiàn)實(shí)。它把檢測(cè)拆解為兩個(gè)獨(dú)立的維度身份識(shí)別和信號(hào)定量二者互不干擾。三、流式細(xì)胞術(shù)“助攻”技術(shù)真正落地編碼微球有了但還需要一種能快速、逐個(gè)讀取微球身份和信號(hào)的儀器。這時(shí)候流式細(xì)胞術(shù)Flow Cytometry成了完美的“搭檔”。流式細(xì)胞儀本身擅長(zhǎng)做一件事讓液體中的微小顆粒排成單行一個(gè)接一個(gè)通過激光檢測(cè)區(qū)同時(shí)讀取每個(gè)顆粒上的多種熒光信號(hào)。這恰好與編碼微球的讀取需求不謀而合。于是編碼微球 流式檢測(cè)的組合誕生了。微球負(fù)責(zé)“承載反應(yīng)”編碼負(fù)責(zé)“表明身份”流式儀器負(fù)責(zé)“高速讀取”。三者結(jié)合液相懸浮陣列技術(shù)才真正形成了閉環(huán)。四、Luminex時(shí)代第一次大規(guī)模商業(yè)化上世紀(jì)90年代這套技術(shù)體系逐漸成熟。1995年美國(guó)Luminex公司成立并于1999年推出第一套商業(yè)化系統(tǒng)——Luminex 100搭載了后來大名鼎鼎的xMAP? Technology。xMAP的核心思想非常簡(jiǎn)單卻極其有效用光譜特征不同的微球區(qū)分不同檢測(cè)項(xiàng)目用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)提高靈敏度再用雙激光流式系統(tǒng)完成讀取。這套方案讓用戶買一臺(tái)儀器、買一套試劑就能自行開發(fā)或采購(gòu)幾十種蛋白的多因子檢測(cè)Panel。此后Luminex平臺(tái)的試劑菜單迅速擴(kuò)展細(xì)胞因子Panel、趨化因子Panel、生長(zhǎng)因子Panel、癌癥標(biāo)志物Panel……幾乎覆蓋了生命科學(xué)研究的各個(gè)熱門領(lǐng)域。其中最著名的生態(tài)合作伙伴之一就是Bio-Rad的Bio-Plex系列。Bio-Plex基于Luminex的核心微球技術(shù)但優(yōu)化了抗體配對(duì)、實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析軟件極大地推動(dòng)了該技術(shù)在科研實(shí)驗(yàn)室的普及。可以說Luminex不是這項(xiàng)技術(shù)的“發(fā)明者”但它是把它變成“人人都能用”的商業(yè)化產(chǎn)品的里程碑。五、為什么后來的微球越來越多變成“磁珠”如果您接觸過近幾年的多因子檢測(cè)試劑盒會(huì)發(fā)現(xiàn)幾乎都強(qiáng)調(diào)“磁珠”Magnetic Beads而非普通微球。為什么因?yàn)樵诿庖邫z測(cè)的流程中需要多次洗滌以去除未結(jié)合的物質(zhì)降低背景噪音。普通微球需要靠離心或過濾來分離操作繁瑣且容易損失微球。而磁珠只需要在試管底部加一塊磁鐵就能在幾十秒內(nèi)把所有磁珠吸附聚集輕松吸走廢液完成洗滌。這個(gè)小小的“磁性”改進(jìn)帶來三大好處操作更簡(jiǎn)便——手工步驟大幅減少。損失更少——磁吸比離心更溫和回收率高。易于自動(dòng)化——自動(dòng)化液體工作站配合磁分離模塊可以全自動(dòng)完成加樣、孵育、洗滌、檢測(cè)全流程。因此磁性編碼微球很快成為主流也是今天“磁珠液相懸浮多因子檢測(cè)”這個(gè)名稱的由來。六、這條技術(shù)路線不只屬于Luminex很多初學(xué)者容易把“多因子檢測(cè)”和“Luminex”畫等號(hào)這其實(shí)是一種誤解。Luminex是這條技術(shù)譜系上最具代表性的商業(yè)品牌但不是唯一。在這條技術(shù)路線下不同國(guó)家和企業(yè)都發(fā)展出了各具特色的平臺(tái)Bio-Rad Bio-Plex是目前全球應(yīng)用最廣泛的Luminex平臺(tái)試劑方案之一。Bio-Rad基于Luminex的編碼微球技術(shù)優(yōu)化了抗體配對(duì)、實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析軟件推出了覆蓋細(xì)胞因子、趨化因子、信號(hào)通路蛋白等多種類別的Panel極大推動(dòng)了這項(xiàng)技術(shù)在科研實(shí)驗(yàn)室中的普及。武漢新縱科是中國(guó)本土液相芯片領(lǐng)域的代表性企業(yè)。公司實(shí)現(xiàn)了流式點(diǎn)陣儀和磁性熒光編碼微球的完全自主研發(fā)其NovaHT流式點(diǎn)陣儀是國(guó)內(nèi)首個(gè)獲NMPA認(rèn)證的流式熒光檢測(cè)平臺(tái)打破了該領(lǐng)域長(zhǎng)期以來對(duì)進(jìn)口設(shè)備的依賴。同步實(shí)現(xiàn)自研的編碼微球也保障了核心原材料的供應(yīng)鏈安全。俄羅斯QuattroPlex則走出了差異化的技術(shù)路線。系統(tǒng)采用一次性卡盒替代復(fù)雜的液路系統(tǒng)大幅減小了設(shè)備體積和重量支持移動(dòng)診斷場(chǎng)景下的便捷使用。其檢測(cè)靈敏度可達(dá)pg級(jí)別單次可檢測(cè)多達(dá)50種分析物樣本量?jī)H需16 μL。它們共享同一個(gè)技術(shù)思想——“編碼微球 液相反應(yīng) 流式讀取”但在微球材料、編碼方式、抗體偶聯(lián)化學(xué)、儀器光學(xué)路徑和算法上各具特色。因此它們之間更像是“同源異流”的關(guān)系而非品牌從屬關(guān)系。七、今天的技術(shù)優(yōu)勢(shì)依然是“無(wú)可替代”的經(jīng)過幾十年發(fā)展磁珠液相懸浮多因子檢測(cè)依然在科研和臨床轉(zhuǎn)化中占據(jù)重要地位因?yàn)樗邆鋷讉€(gè)無(wú)法被常規(guī)方法替代的優(yōu)勢(shì)一個(gè)樣本多個(gè)結(jié)果尤其對(duì)于血清、腦脊液、細(xì)胞上清等珍貴樣本一次實(shí)驗(yàn)就能獲得幾十個(gè)指標(biāo)信息量巨大。液相反應(yīng)效率高抗原抗體在三維空間自由結(jié)合反應(yīng)速度快、靈敏度好。寬動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)線性范圍常可達(dá)34個(gè)數(shù)量級(jí)既能測(cè)高豐度蛋白也能測(cè)低豐度蛋白。靈活組合用戶可根據(jù)研究需要定制不同Panel靈活度遠(yuǎn)超固定芯片。八、未來會(huì)走向哪里如果一定要用一句話總結(jié)這項(xiàng)技術(shù)的精髓我認(rèn)為是一顆磁珠就是一個(gè)獨(dú)立的“檢測(cè)單元”——它用磁性實(shí)現(xiàn)分離用編碼表明身份用抗體完成捕獲用熒光報(bào)告定量由儀器逐個(gè)讀取最終由算法還原出整張蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。未來這項(xiàng)技術(shù)仍會(huì)沿著四個(gè)方向持續(xù)進(jìn)化更高Plex從幾十種向幾百種指標(biāo)發(fā)展。更高靈敏度逼近單分子檢測(cè)水平挖掘更多低豐度生物標(biāo)志物。更低樣本量適應(yīng)單細(xì)胞、微量活檢等前沿應(yīng)用。更高自動(dòng)化與標(biāo)準(zhǔn)化從“手工實(shí)驗(yàn)”走向“全自動(dòng)臨床診斷”讓多因子檢測(cè)真正從實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)醫(yī)院檢驗(yàn)科。結(jié)語(yǔ)從最初的微球免疫檢測(cè)到熒光編碼再到流式懸浮陣列從Luminex的商業(yè)化推廣到磁性微球普及再到如今國(guó)內(nèi)外多種液相芯片平臺(tái)的百花齊放——磁珠液相懸浮多因子檢測(cè)技術(shù)走過了漫長(zhǎng)而精彩的旅程。它改變的不僅僅是檢測(cè)方法更是科學(xué)家觀察問題的方式過去我們一次看一個(gè)蛋白。后來我們一次看一組蛋白。今天我們希望通過一個(gè)樣本看到一個(gè)動(dòng)態(tài)的、交織的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)。而這趟技術(shù)之旅還遠(yuǎn)未結(jié)束。